糖尿病是世界范围内常见和严重的慢性疾病之一。根据《国际糖尿病联合会》第10版报告，2021年全球20~79岁人群糖尿病患病率为10.5%（5.366亿），预计2045年将上升至12.2%（7.832亿）[1]。糖尿病皮肤溃疡（diabetic cutaneous ulcer，DCU）是糖尿病严重的慢性并发症之一，致残率高、治疗费用昂贵[2,3]。糖尿病状态下氧化应激水平过高是DCU患者创面难愈的重要原因，影响创面愈合的各个阶段，严重者发生感染，甚至截肢[3,4,5]。因此，调节机体氧化还原平衡、促进血管新生从而加速创面愈合是加快糖尿病创面愈合的潜在治疗方法。
透明质酸（hyaluronan，HA）是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中的一种高分子糖胺聚糖，由重复的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺二糖单元组成，其功能与其分子量直接相关[6]。目前已有研究证实透明质酸寡糖（hyaluronic acid oligosaccharide，o-HA）（相对分子质量<10 kDa）可通过增强血管生成促进创面愈合，对急性创面有修复作用[7]。本课题组前期研究也证实o-HA可刺激血管生成、加速创面重新上皮化、促进糖尿病大鼠创面愈合[8]，但其促进糖尿病小鼠创面愈合的机制研究尚不深入。为促进o-HA的进一步开发，本研究拟建立DCU模型，探究o-HA对糖尿病小鼠创面愈合的作用及可能机制。
90只雄性SPF级昆明小鼠，6周龄，体质量（22±2）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK（鲁）20190003。小鼠饲养温度22~25 ℃，相对湿度40%~60%。经山东省药学科学院-药物安全评价中心实验动物管理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）批准试验（编号：IACUC-2021-004）。实验时间为2021年4—12月。
o-HA由山东省药学科学院自制[9]（重均分子量：2.7 kDa，批号：20201021）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（北京博爱港生物技术有限公司）；活检穿孔器（Kai medical），黏合剂（Krazy，744-3514），RIPA裂解液（radioimmunoprecipitation lysis buffer，RIPA）和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（上海碧云天生物技术有限公司，P0013B，ST506）；β-肌动蛋白（β-action）（Cell Signaling，8457）；核因子E2相关因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）（Proteintech，16396-1-AP），血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）（Cell Signaling，86806），NAD（P）H醌氧化还原酶1〔NAD（P）H quinone oxidoreductase 1，NQO1〕（Cell Signaling，3187）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（中杉金桥，ZB-2301），辣根酶标记山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（中杉金桥，ZB-2305）；血糖仪（欧姆龙HGM-112型）；血糖试纸（欧姆龙AS1型）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）检测试剂盒（中国南京建成生物工程研究所）。
采用乳化法制备o-HA软膏，即将6.0 g黄凡士林、6.3 g硬脂酸、4.8 g单硬脂酸甘油酯、7.5 g液状石蜡75 ℃加热至融化制成油相，将6.0 g甘油、0.60 g十二烷基硫酸钠、0.075 g尼泊金甲酯、28.8 ml蒸馏水80 ℃加热至融化制成水相Ⅰ，向水相Ⅰ中加入0.3 g o-HA（0.5%）/0.6 g o-HA（1%）/1.2 g o-HA（2%）制成水相Ⅱ，水相Ⅱ缓慢加入油相中分别制备低、中、高剂量o-HA软膏，边加边搅拌，直至冷凝。
参考文献[10]构建糖尿病小鼠模型，所有小鼠于造模前1 d禁食不禁水16 h，次日上午尾部采血测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）后，以150 mg/kg剂量一次性腹腔注射STZ以诱发糖尿病。所有小鼠每周检测FBG水平（禁食6 h），2次或2次以上FBG≥16.7 mmol/L判定为造模成功。
高血糖状态持续6周后造成慢性糖尿病状态，所有小鼠利用全层皮肤切除环形夹板法建立创面模型[11,12,13]（图1）。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉，将小鼠脊柱两侧皮肤的毛发去除干净，使用75%酒精对造模处皮肤进行消毒，以脊柱为中线捏起小鼠背部皮肤，使用直径6 mm的皮肤活检打孔器按压形成两个对称的圆形全层皮肤切除创口，用黏合剂将硅胶夹板固定在创面周围，用5-0缝合线缝合后用无菌透明敷料覆盖创面。实验中共80只小鼠注射STZ，10只因血糖过低或过高死亡，5只造模未成功，2只出现并发症，3只体质量过轻，均未纳入分组。
未注射STZ（注射同等剂量枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液）的血糖正常的10只小鼠作为正常对照组（normal control，NC组）。糖尿病模型建造成功的小鼠按照随机数字表法分为6组：糖尿病模型组（diabetic model，DM组）、重组人表皮生长因子阳性对照组（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF组）、空白基质阴性对照组（matrix组）、低剂量o-HA治疗组（0.5% o-HA组）、中剂量o-HA治疗组（1% o-HA组）、高剂量o-HA治疗组（2% o-HA组），每组10只。NC组和DM组小鼠创面不做任何处理，其他各组每日创面及创周常规消毒后，均匀涂抹o-HA软膏于创面及创周，rhEGF组给药1次/d，0.5%、1%、2% o-HA组给药2次/d，连续给药14 d。
第1、7、14天用相机对创面闭合区域进行追踪，用Image J对创面愈合面积进行量化，得到创面愈合率，公式为：创面愈合率（%）=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积×100%。
连续给药14 d后，取小鼠创面及创周皮肤组织，置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋进行HE染色、Masson染色和免疫组化染色，于光镜下进行观察。通过HE染色观察创面肉芽组织形态学变化，通过Masson染色观察创面组织真皮层胶原纤维沉积情况，通过CD34免疫组化染色观察o-HA对创面新生血管的影响。CD34多用于标记血管内皮细胞，血管腔内一层连续或不连续的阳性着色带，即为染色的内皮细胞。利用CD34免疫组化染色对小鼠创面新生血管密度进行评估，采用Image-Pro Plus 6.0软件计算免疫组化切片照片的阳性细胞数，除以细胞总数，即为每张免疫组化切片的阳性细胞率。
末次给药后各组小鼠分别摘眼球取全血，室温静置1 h，4 ℃，3 000 r/min离心10 min，离心半径8.6 cm，取上层血清，使用相应的试剂盒检测血清SOD、MDA水平。
连续给药14 d后，取小鼠创面及创周皮肤组织，置于1.5 ml冻存管中，液氮速冻后-80 ℃深低温冰箱保存。实验时将创面组织于-80 ℃取出，冰上解冻并称重，剪碎后放于EP管中，按照每20 mg组织加入100 μl裂解液（含1% PMSF）的比例加入RIPA裂解液。功率400 W，冰水浴超声5 s，间隔30 s，次数4次。充分匀浆后，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，离心半径8.6 cm。吸取上清液，BCA法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并将其转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，脱脂奶粉中封闭1 h，TBST缓冲液（TBS with Tween-20，TBST）清洗3次，加入一抗（Nrf2按1∶2 000稀释，HO-1、NQO1、β-actin按1∶1 000稀释），4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次。随后，加入1：20 000稀释的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗，在室温下孵育1 h，TBST清洗3次，增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂进行显色。Image J软件对条带进行定量分析，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的比值作为该蛋白的相对表达量，对结果进行归一化后进行统计分析。
采用GraphPad prism 8.4.2.679软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
第0周时，正常对照小鼠和糖尿病模型小鼠体质量、FBG比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；第2、4、6、8周时，糖尿病模型小鼠体质量低于正常对照小鼠，FBG高于正常对照小鼠，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1、表2。每周检测糖尿病模型小鼠FBG均>16.7 mmol/L，且体质量增长缓慢，出现多饮、多食、多尿、毛发暗黄的表现，认定糖尿病模型构建成功。体内实验时间线见图2。
给药第7、14天，各组小鼠创面愈合率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中给药第7天，DM组、matrix组创面愈合率低于NC组，rhEGF组、1% o-HA组创面愈合率高于DM组，0.5% o-HA组、2% o-HA组创面愈合率低于NC组、高于DM组；给药第14天，DM组、matrix组创面愈合率低于NC组，rhEGF组、0.5% o-HA组、1% o-HA组、2% o-HA组创面愈合率高于DM组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3、图3。
HE染色结果显示，DM组小鼠创面直径最宽，与DM组相比，o-HA和rhEGF处理的小鼠创面直径显著减小，不同剂量o-HA处理创面直径无显著差别，matrix组创面相对较宽；NC组小鼠创面上皮细胞结构正常，真皮层胶原纤维排列整齐；与DM组和matrix组相比，rhEGF组新生肉芽组织几乎取代所有坏死组织，0.5% o-HA组新生血管逐渐闭合，炎性细胞浸润减少，1% o-HA组和2% o-HA组新生表皮较厚，成纤维细胞与纤维细胞数量增多，胶原纤维生成较多（图4）。
Masson染色结果显示，DM组创面蓝染少、着色浅，胶原纤维分布稀疏，排列紊乱；不同剂量的o-HA组蓝染多，着色深，创面胶原纤维排列规则有序，2% o-HA组蓝染较0.5% o-HA组和1% o-HA组浅，胶原纤维生成情况较差。组织形态学分析显示o-HA治疗后肉芽组织、胶原纤维生成增多，表皮结构趋于完整（图5）。
NC组棕色CD34阳性细胞率为（13.40±0.47）%，DM组为（6.34±0.37）%，rhEGF组为（12.62±0.70）%，matrix组为（6.01±1.35）%，0.5% o-HA组为（11.56±0.30）%，1% o-HA组为（14.28±2.26）%，2% o-HA组为（12.68±1.83）%，各组棕色CD34阳性细胞率比较，差异有统计学意义（F=7.162，P=0.001）。其中DM组、matrix组CD34阳性细胞率低于NC组，rhEGF组、0.5% o-HA组、1% o-HA组、2% o-HA组CD34阳性细胞率高于DM组，差异有统计学意义（P<0.05）。
各给药组新生血管排列规律，管腔狭长，呈梭形，1% o-HA组新生血管较为明显；DM组及matrix组血管杂乱，零星分布，且大部分新生血管较细。免疫组化结果显示o-HA对创面周围血管、毛细血管有明显的刺激作用，见图6。
各组小鼠MDA、SOD水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。其中DM组、matrix组MDA水平高于NC组、SOD水平低于NC组；rhEGF组MDA水平低于DM组，SOD水平低于NC组、高于DM组；0.5% o-HA组MDA水平高于NC组、低于DM组，SOD水平高于DM组；1% o-HA组MDA水平低于DM组，SOD水平高于DM组；2% o-HA组MDA水平高于NC组、低于DM组，SOD水平低于NC组、高于DM组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表4。
各组小鼠Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。其中DM组Nrf2、NQO1蛋白表达水平低于NC组；rhEGF组、1% o-HA组Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平均高于NC组和DM组；0.5% o-HA组Nrf2、NQO1蛋白表达水平高于DM组，HO-1蛋白表达水平高于NC组和DM组；2% o-HA组HO-1蛋白表达水平高于NC组和DM组，NQO1蛋白表达水平高于DM组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表5、图7。o-HA促进DCU小鼠创面愈合的机制见图8。
目前，治疗糖尿病难愈创面的方法主要是在控制血糖的基础上预防感染，减轻创面炎性反应。对于一些新兴疗法如生长因子疗法、干细胞治疗，虽然效果显著，但是存在治疗成本高、具有诱导炎症和免疫原性的局限性，因此，对于DCU的治疗，亟需更安全、有效的药物。o-HA由HA经酶解而成，具有促进血管新生的生物活性，从而可以促进创面愈合[14]。虽然文献已报道o-HA可通过增加创面处细胞酪氨酸激酶（steroid recep-tor coactivator，Src）、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）磷酸化以及转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表达，促进糖尿病创面愈合[8]，但是关于o-HA在DCU创面愈合抗氧化作用及氧化应激的机制研究很少。
DCU的发病机制比较复杂，高血糖引发的氧化应激水平升高是其中重要方面，而Nrf2通路是重要的抗氧化应激信号通路，本研究采用腹腔注射STZ的方法诱导糖尿病，建立全层皮肤缺损环形夹板模型，研究o-HA对DCU创面愈合的作用及氧化应激的影响。该模型将环形硅胶夹板紧紧贴附在小鼠创面周围皮肤上，以减少创面皮肤收缩的影响，使小鼠创面最大程度通过肉芽组织生成均匀闭合，从而使创面愈合更接近糖尿病患者创面愈合方式。本研究结果证实o-HA可加速创面肉芽组织生成、增加胶原纤维沉积、加快新生血管生成从而促进糖尿病小鼠创面愈合，改善DCU。此外，本研究结果显示中剂量o-HA软膏对糖尿病创面愈合的治疗效果最佳，和rhEGF凝胶治疗糖尿病小鼠创面愈合的愈合率几乎相同，低剂量与高剂量o-HA软膏治疗效果均不如中剂量组，分析原因可能是给药前需对创面进行消毒清洗，而o-HA浓度越大，越容易在创面部位形成干膏，清洗不到位，影响药物的二次吸收，清洗过度，创面容易撕裂，造成二次创伤；另一方面，高剂量组软膏覆盖在创面表面，可能导致创面透气性不理想。总之，本研究结果表明，o-HA对糖尿病创面具有较好的促愈合作用，表现为明显减小创面面积，显著提高创面愈合率，促进创面肉芽组织形成、胶原沉积以及增加毛细血管密度。
氧化应激在糖尿病各系统并发症中普遍存在，过高的氧化应激水平会对机体中的蛋白质、脂质和DNA造成损伤，最终导致细胞死亡和组织功能障碍[15]。MDA是脂质过氧化物的最终产物，可作为氧化应激的生物标志物[16]。本研究发现，DM组MDA水平升高，经o-HA处理后含量降低。SOD是机体抗氧化损伤酶系统的重要部分，SOD通过催化超氧自由基生成分子氧和过氧化氢来减轻氧化应激[16]。本研究中DM组活力降低，o-HA治疗后逆转了糖尿病引起的总抗氧化能力下降。Nrf2信号通路在维持细胞内氧化平衡方面起着重要作用，是糖尿病、阿尔茨海默病、心血管疾病、DCU、糖尿病肾病等疾病的药物靶点[5]。Nrf2通过调节NQO1、HO-1等基因维持细胞氧化还原平衡。研究表明，Nrf2活化剂SFN可导致Nrf2的核转移以及积累，并增加HO-1和NQO1在糖尿病视网膜病变中的表达[17]。在糖尿病创面愈合中，创面中的活性氧（ROS）导致DNA双链断裂、脂质过氧化、蛋白质变性以及糖尿病创面愈合受损，Nrf2及其下游抗氧化基因明显减少。本研究进一步证实o-HA在抗氧化应激方面的重要性，其可降低机体氧化应激水平，升高Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表达水平，影响Nrf2信号通路促进糖尿病小鼠创面愈合。然而，DCU发病机制复杂，本研究下一步将从能量代谢角度深入探讨o-HA改善DCU的作用机制。
综上所述，本研究证实o-HA可促进糖尿病创面愈合，其机制可能与影响Nrf2信号通路，加速创面闭合和再上皮化，刺激血管新生有关，具有开发为治疗DCU药物的重要潜力。
本文无利益冲突。
参考文献 略
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